Séquençage

Février 2016

Bérénice Batut
berenice.batut@udamail.fr

### Séquençage ADN Détermination de l'ordre d'enchaînement des nucléotides d'un fragment d'ADN/ARN donné

### Pourquoi séquencer l'ADN? Identification de gènes, de régions plus larges, de chromosomes ou de génomes entiers

### Applications - Biologie moléculaire - Biologie évolutive - Métagénomique - Médecine - Forensiques

### Un peu de bibliographie - Revue sur l'histoire du début du séquençage et de la bioinformatique : [*Hutchinson, Nucl Acids Res, 2007*](http://nar.oxfordjournals.org/content/35/18/6227.short) - Revues sur les différentes méthodes de séquençage - [*Metzker, Genome Res, 2005*](http://genome.cshlp.org/content/15/12/1767.short) - [*Metzker, Nature Rev Genet, 2010*](http://www.nature.com/nrg/journal/v11/n1/abs/nrg2626.html) - [*Schadt et al, Hum Mol Genet, 2010*](http://hmg.oxfordjournals.org/content/19/R2/R227.short)

# Méthodes de séquençage

## Première génération

## Seconde génération

### Avantages - Haut-débit - Coûts faibles

### Limites - Amplification - Risque d'erreur - Augmentation de la complexité et du temps associé à la préparation - Génération importante de données - Traitement - Stockage - Séquences courtes

## Entre la 2e et 3e génération

### Ion Torrent - Avantages - Pas besoin de lumière, scanning et caméras - Limites - Système "wash-and-scan" avec une amplification PCR

### Helicos Genetic Analysis Platform Imagerie d'ADN individuels fixés sur une surface plane pendant leur élongation avec une polymérase modifiée et des nucléotides fluorescents

### Helicos Genetic Analysis Platform - Avantages - Pas de PCR - Limites - Arrêt de l'élongation - Taux d'erreur > 5%

## Troisième génération

### Troisième génération 3 principales méthodes - SBS - Nanopores - Imagerie directe

### Sequencing by synthesis (SBS) 2 techniques - Séquençage en temps réel de molécules simples - Séquençage en temps réel avec observation du transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

### Troisième génération Avantages - Pas besoin de PCR (molécule simple) - Haut débit - Délai de production plus courts - Reads plus longs - Plus forte précision - Besoins en ADN plus faibles - Coûts plus faibles

## Comparaison des générations et des méthodes

### Choix de la plateforme A prendre en considération - Application souhaitée - Coût d'un run et de son traitement - Longueur des reads - Nombre de reads par run - Taux d'erreur - Disponibilité

### Longueur des reads - Reads longs - Facilité d'assemblage - Optimal pour des génomes jamais séquencés et la caractérisation du transcriptome - Reads courts - Faibles coûts - Plus forte couverture - Re-séquençage pour applications basées sur la fréquence (comptage)

### Multiplexage Moyen de diminuer les coûts de séquençage - Ajout d'un tag d'identification pour chaque échantilon - Mélange des échantillons - Préparation et séquençage en parallèle - Tri des séquences en fonction des échantillons (information de source contenue dans la séquence)

# Traitement des données issues du séquençage

### Traitement des données issues du séquençage - Gestion des données - Prétraitement des données - Contrôle de la qualité des séquences - Assemblage - Analyses des séquences

## Gestion des données

### Types de données 

### Types de données - Séquençage single-end - 1 fichier de sortie - Séquençage paired-end - 2 fichiers de sortie - Concaténation des fichiers en faisant attention au sens de lecture

### Formats des données brutes - FastA: Format répandu de stockage des séquences biologiques - FastQ (*Illumina*) - SFF (*Roche 454*) - SRF (*Helicos*) - HDF5 (*PacBio, Applied Biosystems, Oxford Nanopore*)

### FastA ``` > Identifiant (Commentaire) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX > Identifiant2 (Commentaire) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XX ```

### FastQ ``` > Identifiant (Commentaire) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX + QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ > Identifiant2 (Commentaire) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX + QQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQ ```

### Score de qualité Mesure de qualité de l'identification des bases par le séquençage ADN Score assigné à chaque base dans les sorties des séquenceurs

### Score de qualité 

### Codage du score de qualité 

### Standard Flowgram Format (SFF) - Format de sortie de 454 et Ion Torrent - Fichier binaire - Section en-tête commune à tous les reads - Pour chaque read - Section en-tête du read - Section des données du read

### En-tête globale d'un fichier SFF 

### En-tête pour un read dans un fichier SFF 

### Données d'un read dans un fichier SFF 

## Prétraitement des données

### Primers, adaptateurs, barcodes 

### Multiplexage / Démultiplexage 

## Contrôle de la qualité des séquences

### Contrôle de la qualité des séquences Plusieurs paramètres à vérifier - Longueur des séquences - Score de qualité des bases - Contenu en bases - Duplications de séquence - Complexité des séquences - Contamination

### Score de qualité des bases 

### Score de qualité des bases 2 niveaux à vérifier - Score de qualité de la séquence entière - Eliminer les séquences avec score moyen < 25 - [Huse et al, Genome Biology, 2007](http://link.springer.com/article/10.1186/gb-2007-8-7-r143) - Score de qualité par base

### Coupure des séquences basées sur le score de qualité par base Coupure de longueur fixe 

### Coupure des séquences basées sur le score de qualité par base Coupure de longueur variable  Utilisation d'une fenêtre glissante 

### Exemples de contrôle de la qualité - [Jeu de données utilisé en TP](data/correct_quality_dataset/SRR029695_fastqc.html) - [Jeu de données de mauvaise qualité](data/bad_quality_dataset/SRR026762_fastqc.html)

## Assemblage

### Assemblage Alignement et fusion de reads en séquences ADN plus longues

### Assemblage 

### Assemblage - **Contig** : Séquence génomique continue et ordonnée générée par l'assemblage de reads qui se chevauchent - **Scaffold** : Contigs chevauchant séparés par des gaps de longueur connue

### Statistiques de séquençage - **Profondeur ou couverture** : Nombre moyen de fois qu'un nucléotide particulier est représenté dans une collection de reads aléatoire - **Profondeur de couverture** : Nombre de reads x Longueur des reads / Taille de l'assemblage

### Métriques d'assemblage Taille de l'assemblage  200 Mpb

### Métriques d'assemblage Nombre de contigs/scaffolds  12

### Métriques d'assemblage Taille moyenne des contigs/scaffolds  16.67

### Métriques d'assemblage Nombre de N  23

### Métriques d'assemblage N50  20

### Utilisation de l'assemblage Alignement sur un génome de référence  - Identification de variants - Reséquençage de génomes

### Utilisation de l'assemblage Assemblage *de novo* Construction des séquences ADN d'un organisme sans génome de référence - Idéal - Longs reads sans erreurs - Problème de simple déduction - Réalité - Reads courts et sujets aux erreurs - Problème d'inférence compliqué

### Outils d'assemblage [> 75 outils](http://omictools.com/genome-assembly-category)

## Analyse des séquences

Note: Choix populaire pour l'étude de l'expression des gènes Alternative aux puces ADN pour l'identification de gènes différentiellement exprimés

Note: Analyses qualitatives et quantitatives des petits ARN non codants microRNAs and other regulatory small transcripts

## Références - [Vidéo sur l'apport d'Ion Torrent par rapport à Illumina](https://www.youtube.com/watch?v=R8rEEUkfC9I) - [QC fail](https://sequencing.qcfail.com) - [Présentation de l'assemblage](http://fr.slideshare.net/kbradnam/assemblathon-2-talk?qid=31d4f62b-27c2-43d8-bf89-9f7074cedf67&v=&b=&from_search=1) - [Différentes applications du séquençage haut-débit](http://omictools.com/sequencing-category)

## [Métagénomique](metagenomique.html)